在生物医学研究领域，当科研人员谈论他们珍贵的RNA样品时，我们常常会听到“把那根试管放在冰上！”和“我希望它不会降解”。RNA相较于在分子生物学研究中使用的大多数大分子（如DNA或蛋白质），本质上不够稳定。这也使得在CRISPR/Cas9实验中使用的RNA（称为“gRNA”）面临着“易碎”的挑战。为了解决这个问题，现有研究表明，gRNA通过化学修饰可以提高抗降解能力，同时仍然保持其引导Cas9产生靶向断裂的功能。这些技术的进步增强了靶向效率，减少了对RNA状态的战略性担忧。

有些gRNA修饰不仅能提高稳定性，还可以增加其功能变化。例如，稳定的gRNA修饰包括磷酸糖骨架改造，crRNA的识别序列由20个核苷酸的gRNA引导，该gRNA是较大的CRISPR RNA（crRNA）的一部分。除了20nt的向导序列，crRNA的3'末端还含有一个20nt左右的重复区域，该区域与Cas9蛋白的相互作用相关联。这些RNA分子因被视为外源RNA而容易受到细胞质和核酸酶的攻击，因此需要有效的保护措施。目前有几种简单的方法可以通过修改RNA的糖或磷酸骨架，提高其稳定性。

自然界已经进化出了一些保护重要细胞RNA分子以防止其通过翻译后修饰降解的机制。其中最常见的一种是2'-O-甲基化，甲基被添加到核糖的2'羟基上，以防止其受到溶核攻击。在同一位点，2'-氟化（2'-F）替代羟基，从而提高稳定性。此外，还有流行的3'-硫代磷酸酯键修饰，其中硫取代了非桥接磷酸氧。其他有效的骨架修饰还包括酰胺键、锁核酸和限制性乙基等。

哪种RNA骨架修饰表现最佳呢？研究表明，几种修饰之间的联合使用，如硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰，能够显著提高稳定性。这些修饰可以利用市售试剂盒在实验室内完成，或在购买gRNA时作为合成修饰选项。为了实现最佳的稳定性和有效性，修饰通常会加入到crRNA分子的末端（通常前3个核苷酸中1-3个被修饰）。那么，有什么比RNA更为稳定的分子呢？答案是脱氧核糖核酸（DNA）！

在预算有限的情况下提高gRNA效率的一种有效方式是将部分核糖核苷酸替换为脱氧核苷酸。含有部分DNA的gRNA能够显著增强其对Cas9蛋白的耐受性，进而提高靶向效率。同时，锁核酸或桥接核酸的引入也有助于增强gRNA的稳定性，从而改善错配识别能力，降低脱靶事件。虽然两者具备相似的优点，但N-甲基取代的桥接核酸在哺乳动物细胞中的效率稍高且毒性较小。

上述一些RNA稳定修饰是在CRISPR/Cas9技术开发之前为siRNA和反义寡核苷酸等应用而发展的。这些合成修饰，特别是那些不含5'-三磷酸盐的修饰，能有效降低引入外源RNA时可能产生的先天免疫反应。这一点在那些因引入外源RNA而可能造成活力损失或正在考察免疫力的实验中显得尤为重要。

在gRNA的技术进步中，采用可光激活和可光切割的gRNA设计，已经成功克服了许多挑战。通过在gRNA的20nt靶向区域中加入可光切割的2-硝基苄基接头，使得gRNA在适当光线照射下迅速裂解，从而失去功能。同时，光激活的系统利用被光笼笼罩的gRNA，在短暂光照后恢复并可启动CRISPR/Cas9靶向编辑事件。这两种技术均依赖于对RNA的化学修饰，并可通过简单的LED灯进行控制。

在目标实验中，对gRNA进行染料标记可以帮助可视化转染效率，甚至在细胞实验中实现追踪。市面上有很多合适的荧光染料可供选择，研究人员可以选择自己动手使用试剂盒，或购买带标签的商业合成染料。而对于单个向导系统（即crRNA和tracrRNA作为一个分子）来说，选择标记并非必要，但多样选择仍让您的实验更加灵活。

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